1.該模型制備比較成熟，國內外都有此模型，構建和評價指標一致，所以該模型應用廣泛，具有統(tǒng)一的操作規(guī)程。

2. 該模型制備的關鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養(yǎng)環(huán)境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統(tǒng)，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫(yī)學應用價值。

1、 臨床癥狀

感染SHIV-KB9病毒后，A0425在感染后第120天出現(xiàn)食欲不振、水樣腹瀉、掉毛和體重減輕，到感染后第130天發(fā)展至嚴重水樣腹瀉，至18周后，愈發(fā)虛弱，直至感染后149天瀕臨死亡，動物安樂處死，并按計劃取材留樣。其余感染猴未出現(xiàn)皮疹、體重下降、食欲不振、機會性感染等典型的艾滋病癥狀。

2、 SHIV-KB9靜脈感染恒河猴外周血病毒載量結果

在血漿病毒載量方面，A423和A424在感染后第7天首次出現(xiàn)陽性，之后載量上升，A423于感染后第14天達到它的最高峰（9.62×107 copies/mL），之后緩慢下降，但在我們的觀察期（161天）內，一直維持在103 copies水平之上。A424在感染后第10天達到一個高峰（5.333×105 copies/mL），之后在103-106之間波動，到感染后第56天達到它的另外一個高峰（6.082×106 copies/mL），后在我們的觀察期內未檢測到病毒載量。A0425病毒載量在28天為7.22×105copies/mL，35天達到高峰3.51×108 copies/mL，隨后下降，至10w降到了104 copies/mL，之后出現(xiàn)反彈，達到4.11×106 copies/mL，并長期維持在這個水平上直至發(fā)病。A426動物在整個實驗期間，未檢測到血漿病毒載量陽性（圖1）。

圖1 SHIV-KB9靜脈感染中國恒河猴外周血病毒載量結果

Fig.1 Theviremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SHIV-KB9

1、 SHIV-KB9靜脈感染恒河猴CD4+/CD8+比值結果

四只實驗猴CD4+/CD8+比例結果顯示，實驗前，其比值均大于1。接種病毒后，A423-A425在感染后前5周有個下降－回升－再下降的過程，其中A423于感染后21天降至最低值0.15，之后緩慢回升，在161天之前都在0.5之下徘徊，之后進入波動期，在0.26-0.78之間波動，但總體趨勢是上升的，并于感染后357天回升至1.08。A424在前五周有幾個幅度較大的波動，并于感染后35天達到最低點0.48，之后緩慢回升，從第35天的0.48一直波動回升到第329天的1.67。A425的初始CD4+/CD8+比值是四只猴中最高的，它在感染后第35天CD4+/CD8+比值達到最低點0.0125，之后緩慢回升，但一直維持在0.2以下，直至安樂處死。 A426的CD4+/CD8+比值在前三個月一直未見異常變化，到感染后91天出現(xiàn)下降，之后回升，維持于1附近（圖2）。

圖2 SHIV-KB9靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio ofT lymphocytes in Chinese-originalrhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

SHIV-KB9靜脈感染恒河猴CD4+細胞絕對數(shù)結果

病毒感染前，A4023-A0426四只猴的CD4+ T細胞絕對數(shù)都在1000個/μL以上。SHIV-KB9感染后，四只猴在感染后前三周都有個上升－下降－再上升－再下降的過程，（圖3）。A0423在感染后21天到達最低點每μL血液中244個CD4+細胞，之后緩慢上升，到感染后203天超過1000個/μL。A0424在感染后28天到達最低點每μL血液中418個CD4+細胞，之后波動上升，到感染7周之后超過1000個/μL。A0425對SHIV-KB9的反應最強烈，在感染后3天它的CD4+ T細胞絕對數(shù)從最初的1073個/μL，迅速升到4270個/μL，到第10天更是升至5254個/μL，之后迅速下降，到感染后35天降為16個/μL，并維持這個水平一直到安樂。A0426也是在感染后28天到達最低點每μL血液中465個CD4+細胞，之后波動上升，到感染11周之后超過1000個/μL。

圖3 SHIV-KB9靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)

Fig.3 The CD4+ T cell counts(per l blood) in Chinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIV-KB9

1、 實驗用病毒：感染毒株為SHIV-KB9中國恒河猴細胞適應株，RT-PCR測定病毒拷貝數(shù)為4.8×108copies/mL。

2、 感染動物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實驗前體檢無異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結果為陰性。所有感染動物必須在ABSL-3室中進行。

3、 感染方法：4只恒河猴編號分別為A0423、A0424、A0425和A0426。病毒原液依次用無血清1640培養(yǎng)液做10倍系列稀釋。經(jīng)后肢靜脈感染，每只猴注射1mL稀釋好的病毒液。A0423-A0426分別注射10-1-10-4病毒液1mL。持續(xù)測定8個月。

4、 SHIV-KB9靜脈感染猴樣品采集和指標測定：在感染前和感染后3、7、10、14、17、21、28、35、42、49、56、70及84天采集猴靜脈血6mL，3mL EDTA抗凝，用于病毒載量和CD4+/CD8+值測定。

5、 SHIV-KB9靜脈感染猴血漿病毒載量的測定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實時熒光定量RT-PCR方法測定血漿病毒載量。

6、 SHIV-KB9靜脈感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對數(shù)測定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標記EDTA抗凝全血淋巴細胞，流式細胞儀測定CD4+/CD8+比值，并根據(jù)血常規(guī)結果，計算出CD4+T細胞絕對數(shù)。

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的傳染性疾病，是20世紀危害人類健康和生命最嚴重的病毒性疾病之一。自美國CDC報道首例艾滋病后，到20世紀80年代中期艾滋病發(fā)展成為一個性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬人，2014年新增感染者200萬，2014年因艾滋病死亡120萬人。艾滋病在1985年傳入我國，截至2015年5月31日，歷年累計報告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關注的公共衛(wèi)生和社會熱點問題，艾滋病的預防與治療也成為當代生物醫(yī)學研究的前沿熱點之一。

二、艾滋病動物模型簡介

艾滋病發(fā)病機制研究、藥物和疫苗的保護性研究及評價等方面在很大程度上依賴理想的動物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應用，表現(xiàn)為和AIDS的臨床表征，發(fā)病過程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV與SIV畢竟是兩種不同的病毒，它們在基因序列、包膜結構和抗原性之間存在一定差異，使該模型的使用有一定的局限性。近年來，人們應用分子生物學技術，將HIV-1重要基因與SIV做成嵌合體病毒（SIV/HIV-1，簡稱為SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒與宿主的相互作用。

Reimann等人以SIVmac239病毒基因組和B亞型HIV-1病毒的env基因為主體構建的一株嵌合病毒，即SHIV-89.6，經(jīng)動物體內傳代及克隆得到SHIV-KB9。由于在中國流行的8種類型毒株中，B'亞型是我國目前主要流行的HIV-1亞型，占47.5%。我國HIV-1B'亞型毒株與B.TH.92.92TH014最為接近，中國HIV-1B'亞型標準株的核苷酸序列與國際常用HMA分型的TH14、IND868、MA959、TH22等序列比較，相應亞型的核苷酸同源性是：B亞型90.2%,88.3%，說明B亞型和B'亞型之間存在很高的親緣性。因此，SHIV-KB9病毒建立的動物模型，對我國的艾滋病疫苗以及疫苗評價和應用意義重大，為我國的疫苗研制提供很好的研究和評價平臺。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經(jīng)血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動物模型的制備首先要考慮其實際應用價值，最好的動物模型可以最大限度的模擬人類疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為充分模擬靜脈注射吸毒人群的感染方式，通過靜脈途徑，病毒直接感染血液中的靶細胞，從而制備靜脈途徑艾滋病恒河猴感染模型。