為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號(hào)幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細(xì)胞的數(shù)量也沒有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時(shí)感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時(shí)時(shí)傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時(shí)感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 生物學(xué)特征

外觀與與普通ApoE基本相同,但呈現(xiàn)消瘦狀態(tài)。

2. 臨床表現(xiàn)

高dsDNA；2、動(dòng)脈斑塊；3、高膽固醇和低密度脂蛋白。

3. 發(fā)病過程

從處理第16周開始，可以檢測到升高的膽固醇和低密度脂蛋白，從處理后第30周開始，可檢測到高滴度dsDNA,同時(shí)伴有動(dòng)脈斑塊。

4. 臨床診斷

油紅染色主動(dòng)脈，確定動(dòng)脈斑塊；ELISA檢測血清dsDNA。

5. 醫(yī)學(xué)用途

研究狼瘡心臟病發(fā)病機(jī)制。

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料:

1. 8周齡ApoE基因缺陷雌鼠（ApoE-/-）

2. 高脂食物: 15.8%脂肪，1.25%膽固醇和0.5%膽酸鹽

3. 降質(zhì)烷

（二）制作方法:

1.降質(zhì)烷注射:8周齡小鼠腹腔注射0.5毫升降質(zhì)烷，飼養(yǎng)于SPF設(shè)施，6個(gè)月后，檢測抗dsDNA 濃度，高滴度dsDNA顯示狼瘡模型建立成功

2.ApoE-/-高脂食物連續(xù)喂養(yǎng)12周

3.模型鑒定：高dsDNA合并主動(dòng)脈斑塊

1.物種：小鼠

2.品系：ApoE

3.人類疾病：紅斑狼瘡

4.傳染性：無

5.微生物：無