目前關(guān)于serinc2蛋白主要集中于研究其作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的抑制劑，在病毒增殖時(shí)，被包裝進(jìn)入病毒顆粒中，從而削弱這些病毒感染新的細(xì)胞的能力。另外，關(guān)于serinc2能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制也越來越受到重視。一方面，目前尚無動(dòng)物模型研究其與各種人類疾病的關(guān)系，因此，成功構(gòu)建serinc2-KO的小鼠模型并探索serinc2蛋白在心血管疾病及其他疾病之間扮演的角色顯得尤為重要。另一方面，serinc2蛋白幫助serine整合到細(xì)胞膜上，促進(jìn)膜脂的生成，可以影響膜的流動(dòng)性和完整性，而這是細(xì)胞維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。Serinc2-KO的純合子小鼠能否存活，在其身上會(huì)發(fā)生什么表型的變化都是一個(gè)待解之謎，通過構(gòu)建serinc2-KO的小鼠模型，或許能幫助我們更加深入的了解serinc2家族甚至非必需氨基酸在生物過程中發(fā)揮的作用。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

1.鑒定結(jié)果

根據(jù)PCR策略示意圖，經(jīng)PCR和測(cè)序確認(rèn)，29#，30#，36#小鼠為F1代雜合子小鼠。

圖1.PCR鑒定結(jié)果圖。

2. Serinc2敲低對(duì)PE誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大水平的作用

敲低Serinc2的表達(dá)，且敲低效率達(dá)到80%。與對(duì)照組相比，敲低Serinc2后，心肌肥厚標(biāo)志物ANP、BNP、Myhh7顯著升高，表明敲低Serinc2基因加重了心肌肥厚水平。

圖2.在新生大鼠心肌細(xì)胞中，敲除ArmH4基因?qū)E所誘導(dǎo)的心肌肥厚水平的影響。

3. Serinc2過表達(dá)對(duì)PE誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大水平的作用

結(jié)果表明，過表達(dá)Serinc2能使serinc2過表達(dá)70倍。與對(duì)照組相比，serinc2過表達(dá)后ANP、BNP的mRNA水平顯著降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在PE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型中，敲低或過表達(dá)serinc2分別加重或者減輕心肌肥大，這為心肌肥厚的治療提供了新的靶點(diǎn)。

圖2.在新生大鼠心肌細(xì)胞中，過表達(dá)ArmH4基因?qū)E所誘導(dǎo)的心肌肥厚水平的影響。

1. CRISPR/Cas9敲除策略：

Serinc2基因有5個(gè)轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)Serinc2基因的結(jié)構(gòu)，將 Serinc2-203基因的exon2-exon10(ENSMUST00000122374.7)轉(zhuǎn)錄本作為敲除區(qū)域。該區(qū)域包含了所有的編碼序列。破壞這個(gè)區(qū)域?qū)?dǎo)致蛋白質(zhì)功能的破壞。

在本項(xiàng)目中，我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Serinc2基因進(jìn)行修飾。簡單的過程如下:sgrna在體外轉(zhuǎn)錄。Cas9和sgRNA微注射C57BL/6JGpt小鼠受精卵。移植受精卵獲得F0陽性小鼠，經(jīng)PCR和測(cè)序證實(shí)。F0代陽性小鼠與C57BL/6JGpt小鼠交配獲得F1代小鼠穩(wěn)定模型。

2.構(gòu)建PE誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞模型，檢測(cè)Serinc2敲低以及過表達(dá)后心肌肥厚分子標(biāo)志物水平。分別提取總RNA，通過qRT-PCR檢測(cè)心肌肥厚指標(biāo)ANP、BNP、Myh6和Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和(或)右心室及室間隔不對(duì)稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。臨床表現(xiàn)：1. 以青壯年多見、常有家族史。2. 可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點(diǎn)異丙腎上腺素及Valsalva動(dòng)作后雜音增強(qiáng)，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時(shí)雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對(duì)性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。臨床診斷：超聲心動(dòng)圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。二、模型背景1、Serinc2基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號(hào)）：230779? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/230779? 敲除基因名稱：serinc2? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000023232;r=4:130253495-130275218;t=ENSMUST00000122374? 方案針對(duì)的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號(hào)）： ENSMUST00000122374.7? 方案敲除的exon：exon 2-102、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。C57BL/6小鼠也被稱為C57 black 6，當(dāng)然有的人也把它叫做B6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個(gè)特點(diǎn)就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。另外C57BL/6小鼠是第一個(gè)完成基因組測(cè)序的小鼠品系，這也為它增加了不少的知名度。毛色：黑色。C57BL/6小鼠的主要用途有如下三個(gè)方面：? 作為生理學(xué)與病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型? 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，百奧賽圖多采用背景純凈的C57BL/6小鼠進(jìn)行基因敲除，保證遺傳背景上的高度穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性。? 作為產(chǎn)生自發(fā)突變和誘發(fā)突變的同基因型小鼠的背景品系。主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對(duì)放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對(duì)結(jié)核桿菌敏感。對(duì)鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對(duì)百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 Serinc2是Serinc（serine incorporate）蛋白家族的極其重要的一員，能幫助絲氨酸整合到細(xì)胞膜上,并促進(jìn)細(xì)胞磷脂雙分子層膜上的磷酯酰絲氨酸和鞘磷脂等成分的生物生成,在膜脂分子生物合成過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。極性氨基酸絲氨酸(serine)屬于細(xì)胞內(nèi)的一種非必需氨基酸,是磷脂酰絲氨酸和鞘脂的重要組成成分[1]。而serinc蛋白存在于所有的真核細(xì)胞的質(zhì)膜中，和其他家族沒有氨基酸序列同源性，其具體的功能尚未研究清楚。但本身高度保守，具有多個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域，幾乎都編碼一個(gè)N端信號(hào)肽，其家族成員內(nèi)部有31%~58%的同源性。Serinc作為一種重要的跨膜蛋白家族，共有5個(gè)成員，serinc1~5，其膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有類似氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的11個(gè)跨膜區(qū)段，且均含有一個(gè)“helix-loop-helix"功能結(jié)構(gòu)域[2]。 最初研究發(fā)現(xiàn)serinc蛋白生物學(xué)活性主要與腫瘤相關(guān)，能夠在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)serinc1能夠阻滯肺癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，從而抑制肺癌組織的復(fù)制[4]。2003年，serinc2（又稱為tumor differentially expressed 2, 腫瘤差異表達(dá)基因2 ）蛋白首次被科學(xué)家Player發(fā)現(xiàn)。目前，關(guān)于serinc2的相關(guān)報(bào)道較少，Player等[5]觀察到serinc2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平較高，并且在正常組織中serinc2不同的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖的相對(duì)速度無關(guān)，提示serinc2在肺癌腫瘤發(fā)生的特殊作用。Zeng等[6]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)serinc2在肺腺癌組織中高表達(dá)，其可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。另外，染色體芯片分析發(fā)現(xiàn)與自閉癥發(fā)生相關(guān)的serinc2基因變異[7]。進(jìn)一步通過全基因組關(guān)聯(lián)研究和meta分析發(fā)現(xiàn)serinc2基因變異與歐洲人群酒精成癮密切相關(guān)，并且可以作為酒精依賴風(fēng)險(xiǎn)的因素進(jìn)行隨訪[8, 9]。 迄今為止尚未有研究發(fā)現(xiàn)serinc2與心血管疾病之間的關(guān)系，但是2015年，美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院，意大利特倫托大學(xué)和瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)在nature發(fā)表論文，揭示了serinc蛋白家族成員能夠抑制HIV（human immunodeficiency virus,人免疫缺陷病毒）病毒顆粒的復(fù)制。在HIV感染時(shí)，兩者能結(jié)合到病毒顆粒中并作為信號(hào)報(bào)警器阻止病毒的進(jìn)一步增殖。參考文獻(xiàn)：1. Muthusamy, T., et al., Serine restriction alters sphingolipid diversity to constrain tumour growth. Nature, 2020. 586(7831): p. 790-795.2. Pye, V.E., et al., A bipartite structural organization defines the SERINC family of HIV-1 restriction factors. Nat Struct Mol Biol, 2020. 27(1): p. 78-83.3. Bossolasco, M., et al., Human TDE1, a TDE1/TMS family member, inhibits apoptosis in vitro and stimulates in vivo tumorigenesis. Oncogene, 2006. 25(33): p. 4549-58.4. Ren, W.H., et al., siRNA-mediated knockdown of hTDE2 retards cell cycle progression through transcriptional activation of p21. Oncol Rep, 2014. 31(3): p. 1314-22.5. Player, A., et al., Identification of TDE2 gene and its expression in non-small cell lung cancer. Int J Cancer, 2003. 107(2): p. 238-43.6. Zeng, Y., et al., SERINC2-knockdown inhibits proliferation, migration and invasion in lung adenocarcinoma. Oncol Lett, 2018. 16(5): p. 5916-5922.7. Hnoonual, A., et al., Chromosomal microarray analysis in a cohort of underrepresented population identifies SERINC2 as a novel candidate gene for autism spectrum disorder. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12096.8. Zuo, L., et al., Genome-wide association discoveries of alcohol dependence. Am J Addict, 2014. 23(6): p. 526-39.9. Zuo, L., et al., A New Genomewide Association Meta-Analysis of Alcohol Dependence. Alcohol Clin Exp Res, 2015. 39(8): p. 1388-95.