為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的功能，我們運用CRISPER/Cas9技術對斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經預測它們的蛋白結構相對于野生型斑馬魚出現移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發現在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導致了mRNA的全面降解所導致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細胞的發育，我們通過斑馬魚中性粒細胞特異性標記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發現npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點的數量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發現SB+陽性細胞的數量也沒有差異。并且進一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細胞中的顆粒，也未發現明顯區別。以上結果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細胞的發育和數量。這可能是因為Npsn只是斑馬魚中性粒細胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細胞的發育，但是可能影響了中性粒細胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細胞功能的影響，而中性粒細胞的主要功能是參與機體的固有免疫反應，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實驗。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發現npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。為了進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的作用，我們通過構建斑馬魚Npsn過表達的轉基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發現Npsn過表達后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結果進一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細胞抵抗感染的呢？先前有體外實驗證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細胞外基質的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗證這個觀點，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細胞的數量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發現明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細胞的完整性，進而影響大腸桿菌在機體內存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發現Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的具體機制，還需要更多的實驗來驗證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應模型，對研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的相互關系，以及對研發新的抗菌藥物具有重要的指導意義。

動物模型的制備和應用實驗必須在具備相應資質的實驗室開展。動物模型的制備、應用過程中的監督管理、處置措施、對環境和生態影響等應符合國家相關法律規定。

Mbd4基因編碼的蛋白MBD4介導DNA修復，可能對慢性炎癥組織的致癌作用非常重要。在人類中，MBD4的序列和表達的改變與癌癥風險的升高有關。MBD4 Glu346Lys多態性與結腸直腸癌、食管鱗狀細胞癌和肺腺癌的風險增加相關。在小鼠實驗表明Mbd4可以抑制潰瘍性結直腸炎癥相關的結腸癌小鼠模型的發病率和死亡率。

F0代構建：采用Cas9進行基因定點敲入。

Mbd4基因編碼的蛋白質是一種多結構域蛋白，包括一個C端單功能胸腺嘧啶-尿嘧啶DNA糖基化酶和一個N端甲基- cpg結合域（MBD），其甲基- cpg結合域將酶定位于基因組的富含cpg的區域，啟動堿基切除修復(BER)，修正由于5-甲基胞嘧啶(5MeC)或胞嘧啶脫氨產生的T:G或U:G錯配。研究表明，MBD4介導的DNA修復可能對慢性炎癥組織的致癌作用非常重要。在人類中，MBD4的序列和表達的改變與癌癥風險的升高有關。MBD4 Glu346Lys多態性與結腸直腸癌、食管鱗狀細胞癌和肺腺癌的風險增加相關。在一些自身免疫性疾病中也觀察到MBD4的多態性或表達改變，這表明MBD4與反常的免疫反應之間可能存在聯系。在小鼠實驗表明Mbd4可以抑制潰瘍性結直腸炎癥相關的結腸癌小鼠模型的發病率和死亡率：Mbd4?/?小鼠比野生型小鼠的生存時間更短，死亡時的腫瘤負荷更大，臨床癥狀更嚴重。組織病理學檢查也發現Mbd4?/?小鼠的炎癥和組織損傷更嚴重。NPSG小鼠為無T，B及NK細胞的NPSG重度聯合免疫缺陷小鼠，其免疫系統缺陷程度與NSG及NOG小鼠同級，體質較強，適用于各類異體移植模型及免疫系統重建模型。