1.評價指標體系

該模型是化學刺激誘導的豚鼠咳嗽模型，咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期是主要的評價指標。

2. 國內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

該模型是化學誘導的豚鼠咳嗽模型，相比于現(xiàn)有模型在造模方法基本一致，以辣椒素吸入誘導豚鼠咳嗽，不同點在與對于咳嗽的計數(shù)方法，目前現(xiàn)有的咳嗽計數(shù)方法主要是通過豚鼠咳嗽時候的狀態(tài)結(jié)合咳嗽時豚鼠出現(xiàn)的聲音判斷咳嗽，具有較大的主觀性而且對于細小的咳嗽不易察覺。本實驗通過全身體積描記系統(tǒng)記錄的豚鼠呼吸波形，表征咳嗽波形圖，通過出現(xiàn)典型的咳嗽波形圖判斷咳嗽，記錄較客觀，同時對于一些細小的咳嗽也可以通過波形圖判斷和記錄。

3. 技術(shù)難點

（1）通過呼吸波，濾過干擾波形，找出典型的咳嗽的波形圖。

（2）辣椒素的濃度摸索。因豚鼠對辣椒素極敏感，且安全窗較窄，極易出現(xiàn)因辣椒素刺激造成的呼吸困難甚至死亡，本研究前期進行了不同濃度的辣椒素霧化探索，最終選擇10-4mol/L辣椒素作為造模濃度，建立穩(wěn)定可靠的豚鼠咳嗽模型。

4. 創(chuàng)新性

使用WBP肺功能檢測系統(tǒng)準確描記豚鼠在腔體內(nèi)因咳嗽產(chǎn)生的劇烈呼氣氣流變化，通過豚鼠咳嗽呼吸波形變化科學的記錄豚鼠咳嗽次數(shù)。使咳嗽的判斷和技術(shù)客觀，準確。

5. 應用價值

采用定量霧化辣椒素法，建立豚鼠咳嗽模型，通過WBP體積描記系統(tǒng)監(jiān)測豚鼠咳嗽波形變化，記錄咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)。相較于人工觀察并結(jié)合動物咳嗽聲音記錄咳嗽的方法，本研究方法更加科學，客觀，是對現(xiàn)有咳嗽模型較好的優(yōu)化和提升。因此，該模型為鎮(zhèn)咳藥物的篩選、藥效評價及可能的機制探索提供了一個穩(wěn)定可靠的動物模型。

實驗動物采用SPF級豚鼠，動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所和平里園區(qū)實驗動物房，屏障系統(tǒng)豚鼠房飼養(yǎng)，實驗設(shè)施許可證SYXK（京）2019-0003。飼養(yǎng)期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

除前面采用咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期作為評價指標，本實驗采用右美沙芬作為陽性對照藥WBP肺功能檢測系統(tǒng)對豚鼠咳嗽波形進行監(jiān)測，可實時描記豚鼠咳嗽波形圖，。

1實驗材料1.1實驗動物

Hartley豚鼠60只，SPF級，雌雄各半，體重260~300 g，動物合格證號：No.110011221101387556。考慮到運輸過程對動物體重的影響，到達動物的體重在±10%范圍內(nèi)的豚鼠全部接收，一并進行檢疫和適應。

1.2實驗材料

1.2實驗試劑

辣椒素：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇：北京化工廠；吐溫80：北京化工廠。

1.3 實驗儀器

全身體積描記系統(tǒng)Buxco Finepointe Whole Body Plethysmograph 4-Site System (WBP) ；美國DSI公司生產(chǎn)。

1.4 飼養(yǎng)管理

實驗地點：動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所和平里園區(qū)實驗動物房，屏障系統(tǒng)豚鼠房飼養(yǎng)，實驗設(shè)施許可證SYXK（京）2019-0003。

飼養(yǎng)環(huán)境：溫度：20~26℃，相對濕度：40～70%；換氣次數(shù)：≥15次/h；照明時間：人工光照12 h明暗周期；清掃與消毒：每日清掃動物房內(nèi)環(huán)境的地面和門，每周定期采用84消毒液或過氧乙酸進行擦拭消毒。

籠具：聚丙烯豚鼠飼養(yǎng)盒，上附金屬格柵蓋。每盒飼養(yǎng)5只豚鼠。消毒與更換：每周2次更換飼養(yǎng)盒，每月更換金屬格柵蓋，采用山東新華醫(yī)療器械股份有限公生產(chǎn)的XG1-I型脈動真空滅菌器對飼養(yǎng)盒和金屬格柵蓋進行滅菌消毒。

飼料：SPF豚鼠生長繁殖飼料，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

墊料：軟木刨花，每周2次更換墊料（與動物盒更換同時進行）。換下來的含有糞便尿液的墊料由與中藥所簽訂合同的生物廢物處理公司處理。

飲用水：實驗動物飲用水，易神州（北京）科技有限公司生產(chǎn)的RO-300型反滲透制水機制得；置于500 mL聚丙烯水瓶中，插在飼養(yǎng)盒水瓶孔中，動物可自由攝取。每周3次更換水瓶，水瓶用山東新華醫(yī)療器械股份有限公生產(chǎn)的XG1-I型脈動真空滅菌器進行滅菌消毒。

動物尸體處理：實驗過程中剖殺的動物的尸體，用包裝袋妥善包裝，放入-20℃冰柜保存，交由簽訂合同的生物廢物處理機構(gòu)處理。

2實驗方法2.1分組及實驗

Hartley豚鼠50只，雌雄各半。按體重隨機分5組，每組10只：模型組、陽性對照組（右美沙芬20 mg/kg）、受試物低、高劑量組（30 、60 mg/kg）、霧化受試物組（40 mg/kg）。按5 mL/kg劑量灌胃給藥，陽性對照組灌胃給予氫溴酸右美沙芬溶液，受試物低、高劑量組灌胃給予相應體積的藥液，霧化受試物組霧化給藥30 min，每天1次，連續(xù)3 d。模型組不處理。

2.2 咳嗽模型

按預定的時間點以0.15 mL/min的速率霧化10-4mol/L辣椒素刺激2min，由全身體積描記系統(tǒng)記錄豚鼠咳嗽潛伏期T（s）及霧化開始12min內(nèi)咳嗽次數(shù)Ct（次）。

3數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，P < 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計學差異。

4實驗結(jié)果

結(jié)果顯示全身體積描記系統(tǒng)記錄的豚鼠咳嗽波形圖，呼吸波形中出現(xiàn)明顯氣流波動，與前后呼吸波形成強烈對比，示意豚鼠咳嗽一次，如圖2所示。

與模型組比較，陽性對照組豚鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)均顯著減少，結(jié)果具有顯著性差異（P<0.01和P<0.01），受試物高劑量組及霧化受試物組可顯著降低模型豚鼠咳嗽次數(shù)（P<0.05和P<0.05），結(jié)果見表2，圖2。

表 2受試物對辣椒素致咳豚鼠的影響（x ?±s, n=10）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

圖2 各組豚鼠咳嗽出現(xiàn)了明顯的呼吸波的變化

1實驗材料1.1實驗動物

Hartley豚鼠60只，SPF級，雌雄各半，體重260~300 g，動物合格證號：No.110011221101387556。

1.2實驗材料實驗試劑

辣椒素：北京索萊寶科技有限公司，批號：423G021；無水乙醇：北京化工廠，批號：20210617；吐溫80：北京化工廠，批號：20210301。

1.3實驗儀器

全身體積描記系統(tǒng)Buxco Finepointe Whole Body Plethysmograph 4-Site System (WBP) ；美國DSI公司生產(chǎn)。

2實驗方法 Hartley豚鼠，進入全身體積描記系統(tǒng)軟件系統(tǒng)，設(shè)置好參數(shù)，將動物放置于腔體內(nèi)，按預定的時間點以0.15 mL/min的速率霧化10-4mol/L辣椒素刺激2min，由全身體積描記系統(tǒng)記錄豚鼠咳嗽潛伏期T（s）及霧化開始12min內(nèi)咳嗽次數(shù)Ct（次）。3數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以均數(shù)±標準誤（Mean ± SEM）表示，采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，P< 0.05為產(chǎn)生統(tǒng)計學差異。

圖1全身體積描記裝置

咳嗽波形圖2：10-4mol/L組吸入辣椒素后期呼吸波出現(xiàn)了典型的變化

1. 目的

采用WBP肺功能檢測系統(tǒng)監(jiān)測腔內(nèi)豚鼠因咳嗽產(chǎn)生的高速呼氣氣流造成腔內(nèi)氣流變化，準確描記豚鼠咳嗽行為，記錄霧化辣椒素誘發(fā)豚鼠咳嗽次數(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定客觀的記錄咳嗽次數(shù)的豚鼠咳嗽模型。用于鎮(zhèn)咳藥物的篩選、藥效評價研究及其可能的作用機制探索。為研究人類咳嗽提供依據(jù)。

2. 意義

采用化學刺激誘導的豚鼠的咳嗽模型是研究咳嗽常用的動物模型，然而目前對于模型咳嗽的判斷主要是基于動物形態(tài)以及聲音，其主觀性比較大而且對細小的咳嗽難以發(fā)現(xiàn)和計數(shù)。我們采用WBP肺功能檢測系統(tǒng)監(jiān)測腔內(nèi)豚鼠因咳嗽產(chǎn)生的呼氣氣流造成腔內(nèi)氣流變化，準確描記豚鼠咳嗽行為，對誘導的咳嗽進行計數(shù)，使之客觀化和準確化。本研究采用定量霧化辣椒素誘導的豚鼠咳嗽模型，應用體積描記法監(jiān)測豚鼠咳嗽波形變化，計數(shù)咳嗽發(fā)生時間和次數(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定的咳嗽模型，是是對于化學誘導豚鼠咳嗽模型的優(yōu)化和提升。

3. 國內(nèi)外研究進展

目前國內(nèi)外文獻中報道目前已有的咳嗽模型均以少數(shù)經(jīng)典，具有代表性的動物模型為主，在造模方法上包括機械化、化學和電刺激等方法刺激動物的神經(jīng)和感受器，引發(fā)咳嗽。其中機械刺激法常采用聚乙烯管或者小鬃毛插入麻醉動物喉部或者氣管內(nèi)進行機械刺激，引發(fā)劇烈咳嗽，但是機械刺激法動物必須在麻醉情況下進行試驗[1]，且刺激強度無法控制，誤差較大使模型的應用受限。化學刺激法多采用化學物質(zhì)刺激呼吸系統(tǒng)引發(fā)咳嗽，目前常用氨水、二氧化硫、枸櫞酸、辣椒素等刺激性物質(zhì)，氣霧吸入或者采用直接注入呼吸道的方法，刺激呼吸道感受器，誘發(fā)咳嗽。咳嗽模型采用的動物包括小鼠、大鼠、貓和犬。如YiKuang等將小鼠置于1000mL玻璃罐中，暴露于2mL的25%氨水中，人工記錄小鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)[2]。AdesolaA等采用歐姆龍霧化器霧化檸檬酸法，誘導豚鼠咳嗽，記錄豚鼠咳嗽次數(shù)[3]。李沛波等采用電刺激法采用一定頻率和強度的電流刺激貓的喉上神經(jīng)、氣管粘膜或者胸膜等部位引咳[4]。其中采用化學吸入刺激法誘導的豚鼠是目前較為常用的模型。

目前已有的咳嗽模型咳嗽的計數(shù)多采用人工計數(shù)法，主要通過動物形態(tài)結(jié)合動物咳嗽聲音等判斷咳嗽的發(fā)生，人為因素較大，而且對于一些細小的咳嗽難易發(fā)現(xiàn)和計數(shù)，影響模型客觀性和可靠性，如何準確計數(shù)咳嗽是咳嗽模型需要解決和提升的問題。

參考文獻：

[1]Wei W, Gao X, Zhao L, Zhuang J, Jiao Y, Xu F. Liquiritin apioside attenuates laryngeal chemoreflex but not mechanoreflex in rat pups. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2020 Jan 1;318(1):L89-L97.

[2]Kuang Y, Li B, Fan J, Qiao X, Ye M. Antitussive and expectorant activities of licorice and its major compounds. Bioorg Med Chem. 2018 Jan 1;26(1):278-284.

[3]Adejayan AA, Ozolua RI, Uwaya DO, Eze GI, Ezike AC. Evaluation of the anti- asthmatic and antitussive potentials of methanol leaf extract of Napoleona vogelii in rodents. Biomed Pharmacother. 2019 Jan;109:120-126.

[4]李沛波,蘇暢,畢福均,王永剛,彭維,蘇薇薇.化州柚提取物止咳作用及其機制的研究[J].中草藥,2008(02):247-250.