SARS-CoV-2感染恒河猴模型
討論與結(jié)論
目前沒(méi)有確證 有效的陽(yáng)性藥物，本單位用細(xì)胞模型從市售成藥中篩選有效藥物，發(fā)現(xiàn) PHD1（藥品代號(hào)）可以在細(xì)胞水平抑制病毒復(fù)制，隨后用小鼠模型進(jìn)行了藥效學(xué)評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)藥物治療感染小鼠后，臨床癥狀得到改善，病毒復(fù)制被顯著抑制，肺組織病理明顯改善，證明該藥物可治療感染小鼠。
生物安全性
評(píng)價(jià)驗(yàn)證
本實(shí)驗(yàn)建立的新型冠狀病毒動(dòng)物模型，采用監(jiān)測(cè)臨床癥狀、病毒學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)和免疫學(xué)等方法進(jìn)行分析和鑒定，確定該動(dòng)物模型成功建立。
（1）癥狀觀察：感染后每天監(jiān)測(cè)體溫，記錄一般癥狀、體重，監(jiān)測(cè)周期14天。
（2）病毒載量：采集 3,4,5,6,7,9,11,14天咽拭子、鼻拭子和肛拭子，感染后7天處1只猴，采集氣管、肺、脾、腸、肝、腎、腦、心、淋巴結(jié)進(jìn)行RNA 抽提，利用 RT-PCR 技術(shù)，檢測(cè)組織中病毒載量。RT-PCR 所用的新型冠狀病毒引物如下：上游為5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’；下游為5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。
病毒分離：肺組織在DMEM溶液中研磨制備成勻漿，離心分離上清后，接種于Vero細(xì)胞分離病毒并觀察細(xì)胞病變。
（3）影像學(xué)檢查：感染后 0,3,5,7,9,11,13,15天做X-RAY檢測(cè)。
（4）病理學(xué)觀察：感染后7天處死1只猴，采集氣管、肺、脾、腸、肝、腎、腦、心、淋巴結(jié)進(jìn)行病理檢查。用新鮮的組織制備冰凍切片，將組織固定在冷凍劑上，肺臟組織（10um）切好后在100%丙酮內(nèi)固定15分鐘，之后用HE染色，鏡下觀察。
（5）免疫熒光染色及免疫組化：肺臟切片用 PBS 洗三遍，用固定液充分固定，用封閉液室溫封閉1h，一抗4°C封閉過(guò)夜，PBS洗三遍，二抗37°C孵育1小時(shí)，PBS洗三遍。用DAPI染細(xì)胞核，觀察新型冠狀病毒在小鼠肺臟上的定位。新型冠狀病毒一抗為病人恢復(fù)期血清，羊源抗人二抗用，F(xiàn)ITC標(biāo)記。
（6）免疫學(xué)檢測(cè)：感染后第3，4，6，7，11，14天全血進(jìn)行白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞檢查和CD3+,CD4+,CD8+,巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，以及血清中特異性抗體。
（7）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法
本實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的定量數(shù)據(jù)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)處理軟件 SPSS(Version. 12.0)進(jìn)行方差分析。
制備方法
1、實(shí)驗(yàn)材料
1.1 攻毒毒株
毒株名稱(chēng)：SARS-CoV-2（原 2019-nCoV, HB-01）
毒株來(lái)源：由中國(guó)疾控中心譚文杰教授提供，新型冠狀病毒的全基因組序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得，存放于中國(guó)微生物數(shù)據(jù)中心（登錄號(hào) NMDC10013001，基因組登錄號(hào)MDC60013002-01）。
毒株培養(yǎng)：將新型冠狀病毒接種到 Vero 細(xì)胞進(jìn)行分離和儲(chǔ)存。Vero 細(xì)胞培養(yǎng)在 DMEM（英濰捷基, 美國(guó)）添加 10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和 100μg/ml 鏈霉素的培養(yǎng)基中，環(huán)境為 37°C，5%CO2。新型冠狀病毒的病毒滴度用標(biāo)準(zhǔn)的半數(shù)細(xì)胞感染率（a standard 50% tissue cultureinfection dose ，TCID50） 進(jìn)行分析。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物名稱(chēng)：恒河猴
動(dòng)物級(jí)別：SPF 級(jí)
動(dòng)物年齡：2-4 歲
動(dòng)物體重：2.5-3.5kg
動(dòng)物來(lái)源：來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
IACUC 批準(zhǔn)號(hào)：BLL20001
2、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程
感染途徑：經(jīng)氣管感染
感染劑量：1×106TCID50/只
感染體積：1 ml/只
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （1）臨床表現(xiàn)恒河猴感染后一般狀態(tài)尚可，活動(dòng)下降，1#體重未發(fā)生明顯變化，3#和 6#體重顯著下降。3只猴感染后體溫未發(fā)生明顯變化。
（2）病毒核酸檢測(cè)
恒河猴在感染后第 3，4，5，6，7，9，11，14 天采集鼻、咽、肛拭子進(jìn)行病毒載量檢測(cè)。結(jié)果顯示在鼻和咽部可持續(xù) 11 天檢測(cè)到大量病毒核酸（見(jiàn)圖 4， 表 1），在消化道可持續(xù)檢測(cè)到病毒核酸的時(shí)間為 11 天（見(jiàn) 2）。其中，鼻部和咽部的病毒高峰期在第 3-6 天，消化道的病毒高峰期在第 3-7 天，消化道病毒載量低于呼吸道病毒載量，但病毒在消化道復(fù)制持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。
恒河猴感染后第 7 天，采集氣管、肺、脾、腸、肝、腎、腦、心進(jìn)行病毒載量檢測(cè)。結(jié)果在鼻、扁桃體、下頜淋巴結(jié)、氣管和左肺上葉檢測(cè)到病毒核酸。
（3）病毒抗原檢測(cè) 恒河猴感染 7天后尸檢，通過(guò)免疫組化可在肺部和小腸內(nèi)檢測(cè)到病毒抗原，主要分布于肺泡上皮、腸上皮，及肺腸的巨噬細(xì)胞內(nèi)。
（4）病理學(xué)檢查恒河猴感染 7 天后尸檢，大體病變，右肺出現(xiàn)深紅色多灶性病變，斑塊大小不一，或散在或連成一片在。
主要組織病理學(xué)改變?yōu)椋悍闻K血管擴(kuò)張充血，肺泡隔增寬，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞滲出（黑色箭頭），血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)（綠色箭頭）
主要病變?nèi)缦拢?/p>
① 肺
左肺上葉：血管擴(kuò)張充血，肺泡隔輕度增寬，肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，少 數(shù)血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)。
左肺中葉：肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血，
左肺下葉：肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，血管周?chē)倭垦准?xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血，出血。
右肺上葉： 肺泡隔輕度增寬，肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，血管周?chē)倭垦准?xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血。
右肺中葉： 肺泡隔輕度增寬，肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，血管周?chē)倭垦准?xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血。
右肺下葉： 肺泡隔增寬，肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血。
右肺副葉： 肺泡隔增寬，局部肺泡腔縮窄，肺泡內(nèi)少量炎細(xì)胞滲出，血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血。
② 其他臟器
右腎間質(zhì)小灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；鼻甲局部上皮脫落。胃粘膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)。扁桃體粘膜表面可見(jiàn)膿性滲出物。十二指腸、回腸粘膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞脫落。空腸絨毛內(nèi)可見(jiàn)寄生蟲(chóng)卵。唾液腺小灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
（5）影像學(xué)檢查感染后，隔天檢測(cè)恒河猴的肺部影像學(xué)改變，第11天右肺上葉透亮度減低內(nèi)可見(jiàn)增粗肺紋理，呈磨玻璃密度改變，水平裂可見(jiàn)，呈細(xì)線狀。第13天右肺上葉透亮度進(jìn)一步減低，肺紋理增粗，部分顯示不清，水平裂不均勻增厚；左肺上葉肺條理增粗，呈磨玻璃密度改變。第15天時(shí)，右肺上葉實(shí)變，邊緣模糊，內(nèi)可見(jiàn)支氣管像，水平裂增厚；左肺上葉肺條理增粗，呈磨玻璃密度改變。
（6）免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果恒河猴感染后第3天白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)顯著下降，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比例上升，這與臨床患者表現(xiàn)極為接近。感染后CD3+CD8+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量顯著下降，這種表現(xiàn)與臨床患者極為接近，分析與病毒感染直接相關(guān)。
恒河猴感染后第 3，4，6，7，11，14 天檢測(cè)血清中特異性 IgG,結(jié)果顯示恒河猴產(chǎn)生特異性 IgG 有明顯的個(gè)體差異，6#感染后第 11 天開(kāi)始產(chǎn)生特異性 IgG.
研究背景
1 研究目的與意義
利用SARS-CoV-2感染恒河猴，觀察并檢測(cè)感染后的臨床癥狀、病原學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)和影像學(xué)指標(biāo)，獲得SARS-CoV-2感染引起肺炎發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，構(gòu)建恒河猴模型，滿足致病機(jī)制、疫苗和藥物評(píng)價(jià)、傳播途徑等研究對(duì)動(dòng)物模型的需求。
2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
2019年底，在中國(guó)湖北武漢華南海鮮市場(chǎng)爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情[1]，已經(jīng)波及全中國(guó)及其他許多國(guó)家，被世界衛(wèi)生組織定義為“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[2]。當(dāng)務(wù)之急是要找到預(yù)防和治療新型冠狀病毒的有效措施，因此，研究新型冠狀病毒在體內(nèi)的致病機(jī)制迫在眉睫。構(gòu)建新型冠狀病毒肺炎的動(dòng)物感染模型，不但為了解該疾病的致病性和病理?yè)p傷特征打下基礎(chǔ)，也是評(píng)價(jià)相關(guān)藥物和疫苗的有效性和安全性時(shí)，不可或缺的工具和科技支撐。
從臨床表現(xiàn)來(lái)看，新型冠狀病毒肺炎起病以發(fā)熱為主要表現(xiàn)，可合并輕度干咳、乏力、呼吸不暢、腹瀉等癥狀，流涕、咳痰等卡它癥狀少見(jiàn)。一半患者在一周后出現(xiàn)呼吸困難，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。部分患者起病癥狀輕微，可無(wú)發(fā)熱等臨床癥狀，多在1周后恢復(fù)。多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重，甚至死亡。從影像學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，早期呈現(xiàn)多發(fā)小斑片影及間質(zhì)改變，以肺外帶明顯。進(jìn)而發(fā)展為雙肺多發(fā)磨玻璃影、浸潤(rùn)影，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺實(shí)變，胸腔積液少見(jiàn)（圖1）。
從免疫學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，患者還可出現(xiàn)發(fā)病早期外周血白細(xì)胞總數(shù)正常或減低、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，部分患者出現(xiàn)肝酶、肌酶和肌紅蛋白增高。多數(shù)患者C反應(yīng)蛋白和血沉升高，降鈣素原正常。嚴(yán)重者D-dimer二聚體升高，淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少。從組織病理學(xué)表現(xiàn)來(lái)看，患者表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，肺泡腔大量的多核巨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡比彌漫性增厚，肺泡間隔增寬（圖2）。
因?yàn)樾滦凸跔畈《荆⊿ARS-CoV-2）跟嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高度的同源性，我們?cè)赟ARS-CoV動(dòng)物模型研制期間，發(fā)現(xiàn)恒河猴對(duì)該病毒敏感，感染病毒后，可在肺組織內(nèi)復(fù)制，且宿主免疫反應(yīng)和病理表現(xiàn)與臨床相似[4]，因此選用恒河猴用于模型構(gòu)建。
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[3]. Lu, R., et al., Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novelcoronavirus: implications forvirus origins and receptor binding. The Lancet, 2020.
[4]. Qin C, et al.,Ananimal model of SARS producedby infection of Macacamulatta with SARS coronavirus.J Pathol. 2005 Jul;206(3):251-9.
模型信息
中文名稱(chēng):SARS-CoV-2感染恒河猴模型
英文名稱(chēng):NA
類(lèi)型:新型冠狀病毒動(dòng)物模型
分級(jí):NA
用途:用于新冠肺炎COVID-19致病機(jī)制研究、疫苗和藥物評(píng)估。
研制單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所
保存單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
